体外诊断试剂临床试验系列问答（二）

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体外诊断试剂注册申报资料中临床伦理文件的提交应注意哪些事项

体外诊断试剂注册申报时，临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。在该部分申报资料中，应提交伦理委员会的审查意见，以及受试者的知情同意书样本。 　　伦理委员会同意开展临床试验的书面意见应提交原件，由伦理委员会盖章，应写明方案版本号和版本日期，应注意产品信息和临床试验信息与实际临床情况的一致性。如在试验过程中发生方案修改，应经过伦理委员会的同意，并提交伦理委员会对方案修改的意见。进行临床试验的机构均应提交伦理委员会的审查意见，如特殊医疗机构（例如疾控中心等）确无伦理委员会，则应由机构出具相关的情况说明，以及对伦理方面的意见。 　　如临床试验经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意，应在伦理委员会书面意见中明确免于知情同意，应避免出现实际试验免于知情同意，但伦理委员会的书面意见中仍出现知情同意书的情况。

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SMN1基因外显子缺失检测试剂的临床价值及相关产品审评情况

脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，居儿童致死性常染色体隐性遗传病的第2位。位于染色体5q11.2~q13.3上的运动神经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因。 　　人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基不同。SMNl是主要功能基因，该基因突变可导致SMA发病，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA表型。目前已知约94％的SMA患者为SMNl基因第7和（或）第8外显子纯合缺失所致，少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。SMN1基因外显子缺失检测在SMA诊断中的意义 　　SMA以脊髓前角运动神经元退化变性为特征，临床表现为进行性、对称性四肢近端和身体躯干肌肉无力、萎缩和瘫痪。根据发病年龄和肌无力严重程度，临床上将SMA分为I、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型和少年型，严重程度依次递减。一般的，神经专科医生根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断，辅助检查方法包括肌电图、肌酶和肌肉活检，结合家族史和SMN1基因分析可进行确诊。肌电图是定位诊断，特异度不高；肌酶在鉴别其他肌无力疾病中有参考意义，但对SMA诊断无特异性；肌肉活检由于取材的创伤性，患儿不易接受。由于SMA患儿中约94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因此SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断具有更高的灵敏度和特异性，且对不同型的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，也就是说SMN1纯合缺失的检测对于不同型SMA患者具有相同的临床诊断价值；同时与有创的组织学诊断相比，基因检测更易被接受。事实上，在欧美人群中，SMN1基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断SMA的首选方法。SMN1基因外显子缺失检测在产前诊断和筛查中的意义 　　SMA在人群中的发病率为1/~1/，群体携带者频率为1/35~1/50，是出生缺陷的高危因素。由于该病严重危害人类健康，且基因位点明确，因此极有必要进行SMA携带者的人群筛查。通过SMN1基因外显子杂合缺失突变的检查可确认无症状的携带者。当夫妻双方均为携带者时，可对其进行遗传咨询，评估生育患儿的遗传风险，并可以通过产前诊断技术降低人群中SMA患儿的出生率。在欧美等国家很早就建议在普通人群中进行SMA携带者的筛查。 　　但在SMA患儿临床诊断和SMA携带者筛查中，对SMN1基因外显子缺失检测的要求是截然不同的，前者仅需准确检测出SMN1基因外显子纯合缺失，后者则需要鉴别SMN1基因外显子杂合缺失。SMN1基因缺失检测试剂的现状 　　目前，SMN1基因外显子缺失检测试剂较为缺乏。临床检验实验室较为公认的方法是PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法，但该方法操作较为繁琐，且重复性差，不利于标准化，不易推广。这种方法只能检测出纯合缺失，无法确认杂合缺失。 　　荷兰的SMAMLPA检测试剂可对待测靶序列进行半定量分析，因此既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失。在国内外已有多篇文献报道采用该方法进行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产品目前仍为“仅用于研究”的试剂，尚未按照体外诊断类医疗器械上市（98/79/EC）。 　　年底，CFDA批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内参基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数进行相对定量检测，用于脊肌萎缩症（SMA）患者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外显子缺失检测的难点之一在于排除高同源性基因SMN2的干扰，特别是对于SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果的准确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定量、绝对定量技术进行系统整合，并在反应体系中加入特定化学组份，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异性，从而有效控制SMN2基因非特异性扩增对检测结果的影响，准确检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7外显子和第8外的缺失情况。 　　鉴于国内外尚无任何按照体外诊断试剂批准上市的SMA分子诊断产品，因此临床试验方案中依据EMQN关于《SMA分子诊断最佳实践指南》，采用了国内外SMA体外辅助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试验共完成例，其中正常对照组例，SMA病例组例，统计分析结果显示申报产品与对比方法检测结果的一致性为%（95%置信区间：99.66%-%）。此外，例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分布范围的调查亦显示，该产品的纯合突变判断界值设置合理。 　　该试剂目前批准的预期用途仅包含纯合缺失的检测，尚不能用于杂合缺失的检测。因此无法用于SMA携带者的筛查。这是该产品的缺陷之一。但事实上该产品在设计上已考虑到SMA携带者的检测。该产品的检测原理是以待测样本中目标外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个梯度稀释品中目标外显子荧光信号Ct值与内参基因荧光信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差，即△△Ct，作为待测样本中目标外显子拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。依据实时荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量△△Ct的计算公式，依据这一计算公式可推导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct理论值（或范围）；再结合目标外显子与内参基因扩增效率差异以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述△△Ct理论值进行优化；结果显示纯合缺失、杂合缺失和野生型的△△Ct值（或范围）之间可设置合理的判断界值，因此理论上该产品可分别检测出三种基因状态。但鉴于生产企业对杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不透彻，再加上缺乏可判定杂合缺失的对比方法等其他困难，本次注册申请的预期用途仅限于检测纯合突变，即SMA患者辅助诊断。小结 　　综上，SMN1基因外显子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者筛查中具有重要的临床价值。然而到目前为止，受到技术水平的限制，相关的体外诊断试剂比较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛查的杂合缺失检测，尚无适合的体外诊断试剂上市。

参考文献：王佶等.脊髓性肌萎缩症SMN1和SMN2基因拷贝数变异分析.中国循证儿科杂志,年03期.张文慧，曹延延等.运用MLPA技术分析脊髓性肌萎缩症患儿SMN1基因的部分缺失.中华医学杂志，.95（6）.江雨，周裕林,脊髓性肌萎缩症SMN1基因携带者筛查技术研究进展.中国产前诊断杂志（电子版）,5(02):34-39.

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试剂盒说明书中的参考值涉及不同的年龄分布，应怎样进行临床试验样本选择

临床试验设计过程中，纳入病例数除 　　对于目前临床上没有可参照的临床参考标准或现有临床参考标准不能全面评价产品临床性能的情况，临床试验设计时，在确认被测物临床检测意义的前提下，还应依据现有临床实践和理论基础选择适当的实验室方法进行检测性能评价，例如：与临床公认的、标准化的实验室参考方法进行对比试验。如果有境外已批准上市的同类产品，与试验用体外诊断试剂具有相同的预期用途，且该产品经过了充分的性能验证和确认，实验室检测过程中可实现良好的质量控制，并被临床广泛认可能够用于相关标志物检测，则该产品亦可作为实验室检测方法用作对比方法。

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如何判定一个体外诊断试剂是否属于防治罕见病相关产品

体外诊断试剂产品是否属于防治罕见病相关产品，应依据《罕见病防治医疗器械注册审查指导原则》（年第号）、《关于公布第一批罕见病目录的通知》（国卫医发〔〕10号）及《国家卫生健康委办公厅关于印发罕见病诊疗指南（年版）的通知》（国卫办医函〔〕号）等文件判定。如申报产品临床适用症为第一批罕见病目录中的疾病，且依据罕见病诊疗指南（年版），该疾病的诊疗流程中需进行申报产品对应的检测项目的检测，则该产品可认定为防治罕见病相关产品。对于申报产品检测项目为新研发的生物标志物，应明确产品预期用途及其与相关罕见病诊疗的关系,从而判定其是否属于防治罕见病的产品，必要时可与我中心沟通咨询。

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与免临床目录描述不一致，还可以免临床吗

免临床目录中的产品如白介素检测试剂，目录用途描述为“用于检测人体样本中的白介素，主要用于监测机体的免疫状态、炎症反应等。”，白介素种类较多，其中产品声称符合上述用途的各种白介素检测项目均可作为免临床产品进行申报，若产品有新的预期用途，如用于特定病原体感染的辅助诊断等用途则不属于免临床产品。 　　血气检测试剂目录用途描述为“与血气分析系统配套使用，用于测定人体样本中的pH值、二氧化碳分压（pCO2）、氧分压（pO2）、红血细胞比容、钠、钾和钙离子浓度等电解质分析。临床上主要用于监测酸碱平衡失调、缺氧及二氧化碳潴留等。”，申报产品检测项目除以上描述的内容，如还包括氯离子、氧合血红蛋白、血氧饱和度等一些常规血气检测项目亦可作为免临床产品进行申报。

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体外诊断试剂临床试验中对样本使用的抗凝剂有何要求

体外诊断试剂的检测样本涉及不同抗凝剂时，应在临床前研究阶段对不同抗凝剂进行研究，验证抗凝剂的适用性及其对检测的影响。一般情况下，如经前期研究认为说明书声称可用的抗凝剂对样本检测不存在差异性影响，则临床试验过程中无需分组纳入使用不同抗凝剂的样本，所有适用的抗凝剂均可在临床试验样本中使用；特殊情形下当不同抗凝剂对检测结果有显著影响，导致临床检测结果的判定有不同参考值等情形，则临床试验中应分别进行样本收集和研究。 　　临床试验方案和报告中应明确说明样本类型及样本使用的抗凝剂。